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壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法
壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法
技能領域
本發明觸及基因工程技能領域，供給了壹種用蓖麻毒素殺傷特定腫 瘤細胞的方法。
布景技能
壹百年前,醫學家已發現某些腫瘤患者被病毒感染後會出現腫瘤暫 時性闌珊的現象，初步設想試用各種病毒來治療腫瘤。至七十年代初, 人們發現有38種病毒對腫瘤具有治療效果，並初步進行臨床試驗，但 由於其時出產、純化工藝及病毒的毒性等要素，其臨床效果並不誌向。 至九十年代初，Martuza等運用基因工程的方法將病毒基因組進行改造, 使病毒感染、拷貝及溶解細胞才幹在腫瘤細胞內得到有用增強，而在正 常細胞內這種才幹削弱乃至消失，改造後的病毒能特異性殺滅腫瘤細胞, 而對正常細胞影響不太大。
這種能在腫瘤細胞內特異性增殖的病毒稱之為腫瘤增殖病毒或溶
瘤增殖病毒（Nature Med. 2001,7(7):781-787; Nature Biotech. 2000,
18(7):723-727)。近十年來，這方面研討方興未已，現在己有十多種病
毒進入或即將進入腫瘤的臨床試驗，尤其是ONYX生化制藥公司研發 的腺病毒Elb55kDa蛋白缺失腫瘤增殖腺病毒ONYX-015的取得了令人
煽動的n期臨床效果，並於1999年進入m期臨床試驗（Nature Medicine. 2000; 6(8): 879-885)。
為完結病毒靶向治療腫瘤這壹方針，進行了以下三方面的研討。
1、壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法增強感染的特異性：病毒的感染是通過其外殼蛋白與細胞表面的 受體結合，然後內吞入細胞的進程。病毒的外殼蛋白改造可改動病毒對 細胞的親嗜性，這方面研討是近年研討的搶手之壹，就腺病毒而言，隨著對腺病毒外殼的纖維蛋白及腺病毒受體的蛋白質立體結構的識別，其 病毒外殼蛋白改造導致腺病毒細胞靶向性改造已有數十篇文章報導 (Nature, 1999,401:935-938; Molecular Therapy. 2000;1(5): 391-405)。現在腺病毒外殼的改造較集中於纖維蛋白。其間纖維蛋白頭 部對細胞親嗜性最為重要，在不同血清型的腺病毒中，其頭部的HI環 長度變化及差異最為顯著，提示在HI環最適合進行基因潤飾，包含插 入壹些對某種受體有高親和力的小肽等以改動腺病毒對細胞的親嗜性。 由於現在小肽親嗜力的研討是建立在單鏈肽的根底之上，而腺病毒纖維 蛋白是壹種三螺旋結構，單鏈肽的親嗜力並不能代表該肽刺進腺病毒纖 維蛋白後它仍具有高親嗜性。因而建立大數量腺病毒纖維蛋白頭部隨機 突變潤飾的腺病毒庫以及體外、體內快速選擇作業，對尋找特異性感染 各種腫瘤細胞的增殖型腺病毒具有至關重要意義。
2。壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法 增強拷貝的特異性：首要通過某些特異性發動子來操控病毒增 殖所必需的基因，然後使病毒只能在腫瘤細胞內增殖（Cancer Research. 1997; 57 (13): 2559-2563 ; The Journal of Clinical Investigation.2000;106(6):763-771)，這種發動子包含：（1).針對全部 腫瘤特征的發動子，如缺氧發動子、端粒酶的發動子等；（2).針對單個 腫瘤特征的發動子，如肝癌的甲胎蛋白(AFP)發動子、胃癌及結腸癌的 癌胚抗原(CEA)發動子、乳腺癌及卵巢癌的DF3發動子、黑色素瘤的酪 氮酸酶發動子等；（3).針對某壹類組織特征的發動子，如選用前列腺細 胞特異性抗原發動子來殺滅前列腺細胞包含前列腺癌細胞，這種方案可 打敗腫瘤細胞的異質性帶來的問題，由於腫瘤細胞不管怎樣改動，總是 帶有該組織的某種基本特征，但這種方案要求這類組織在人體中並非是 至關重要的，殺滅這類組織並不會危及生命，如前列腺細胞、卵巢細胞、
"某種類型的淋巴細胞等。
3、 壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法腫瘤細胞特異增殖病毒
美國ONYX生化制藥公司研發的壹種腺病毒，它是首要運用於腫 瘤患者的病毒。由於該病毒缺失E1B55KD蛋白，所以當它感染正常細 胞時，不能抑制p53基因的激活，然後使細胞很快雕亡，病毒不能再增殖，然後使感染中止。而在腫瘤細胞中p53突變或失活，由於P53功用 缺失，故不能引起細胞去世，而ONYX-015仍能在腫瘤細胞中拷貝及增 殖，終究病毒導致腫瘤細胞溶解去世，並開釋新的病毒感染其它腫瘤細 胞。經5年多的研討，現已有15個研討中心運用ONYX-015完結了約 對250例患者的臨床研討。
現在單用腫瘤增殖病毒治療腫瘤仍不十分誌向，如上述已說到腺病 毒ONYX-015單獨治療只要15%-20%的臨床有用率，它必須聯合常規 化療才幹達到令人煽動的效果。首要原因是腫瘤構成的機制十分復雜， 異質性十分強，即使同壹患者的腫瘤細胞也存在顯著差異，運用某壹腫 瘤機制而增殖的病毒缺乏以殺滅全部腫瘤細胞;其次，腫瘤組織中的物理 要素如纖維化、混入正常細胞以及壞死區域也或許束縛病毒渙散;再次某 些腫瘤的病毒受體（如柯薩奇病毒受體）表達不充分束縛病毒對其感染; :第四，患者的免疫反應束縛病毒增殖和播散。因而怎樣前進腫瘤增殖病 毒有用性是腫瘤增殖病毒研討的核心問題。
為增加病毒的感染力：以腺病毒為例,腺病毒的纖維蛋白頭區錨著 在細胞表面首要受體柯薩奇腺病毒受體，病毒可通過外殼蛋白與靶細胞 表面的整合素a v 及a v 互相效果，然後進入細胞。短少這兩 種靶細胞因子中的任何壹種就會束縛腺病毒載體有用的基因轉運。對原 代腫瘤（原代細胞株、原代移植物、無缺的原代腫瘤標本）研討成果表 明許多上皮細胞癌短少CAR，然後使腺病毒難以轉染原代腫瘤細胞。因 此增加病毒的感染力將前進腫瘤增殖病毒的治療療效，壹同高感染力的 病毒可削減其運用劑量，然後減小毒副效果。現在這方面較為成功的是 美國Alabama大學Ciiriel教授領導的基因治療組，他們在HI環中刺進 RGD小肽（精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸），導致腺病毒對多種腫瘤細胞
感染率大大增加（Cancer Research. 2000; 60(24):6784-6787)。
4、壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法增加病毒的殺傷力：
即將抗癌基因刺進腫瘤增殖病毒基因組中，該方案除了病毒直接殺 滅腫瘤細胞外，其刺進抗癌基因的基因拷貝數隨著病毒在腫瘤細胞內特異性拷貝而成千上萬倍增加，然後數百倍乃至上萬倍前進抗癌基因的表 達量，進壹步加強腫瘤增殖病毒對腫瘤的殺滅效果，它打敗了傳統腫瘤 基因治療的轉染率低、靶向性差、抗瘤基因表達量低以及腫瘤增殖病毒 對腫瘤殺傷力缺乏的缺陷。現在選擇抗癌基因的首要依據是遵從安全、 有用兩個準則，現在國際上首選的抗癌基因是編碼藥物激活酶(也有人 稱之為自殺基因），如單純皰疹病毒的胸腺嘧啶脫氧核甘激酶（HSV-tk)、 大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（CD)及細胞色素P450等，這種基因可以直接 殺滅腫瘤細胞，成果比較直接，更為重要的是這些基因不會產生危險， 當病毒過量產生時，可打針無毒性的前藥如更昔洛韋（GCV) 、 5-氟胞 嘧啶（5-FC)殺滅病毒。
5、壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法尋找新式效果機制的腫瘤增殖病毒
發現壹些新的效果機制的腫瘤增殖病毒是該研討領域最令人興奮 的事，如呼吸道腸道過濾性病毒（reovirus)特異性殺滅Ras高表達的 腫瘤細胞，而水泡狀口炎病毒(VSV)與幹擾素聯合治療特異性殺滅幹擾
素信號異常的腫瘤細胞等（Science. 1998;282 (5392): 1332-1334 ; Nature Medicine.2000，6(7):821-825)。
發明內容
本發明的意圖是供給 壹種耙腫瘤細胞表達蓖麻毒素B鏈基因的重 組腺病毒。
本發明的另壹個意圖是供給壹種上述重組腺病毒的運用，即將 該重組腺病毒用於殺傷特定的腫瘤細胞。
本發明選擇蓖麻毒素蛋白作為殺傷腫瘤細胞的元件。蓖麻毒 素是壹種毒蛋白，可以從蓖麻籽中提取得到。培育細胞溶液中， 在10—12M低濃度足以殺傷細胞。對小鼠致死劑量，腹腔打針為 0.2—0.5微克，靜脈打針為0.1微克。腫瘤單克隆抗體靶向殺傷 腫瘤細胞的研討中，蓖麻毒素曾是廣泛運用的殺傷元件。
蓖麻毒素分子由A、 B二條多肽構成，A鏈是毒素的活性部份，進入細胞內，損壞核糖體致細胞去世。B鏈無毒性，功用是帶著A 鏈進入細胞。單A鏈並不能進入細胞，並無毒性。切當地說，只 有無缺毒素萬分之壹的毒性。
蓖麻毒素分子由A、 B通過壹對二硫鍵相連。但即使沒有二硫 鍵銜接，A、 B 二鏈能依托疏水特性互相結合，解離常數為1x10—7M。 通過二硫鍵銜接的A、 B解離常數為lxl(T12M。蓖麻毒素對腫瘤細 胞的殺傷無特異性，是通過毒素B鏈與細胞膜上半乳糖殘基結合 進入細胞並殺死細胞。
假如有壹種在腫瘤細胞內繁殖、而在正常組織中不繁殖的基 因工程重組耙向病毒並表達滿足量的蓖麻毒素蛋白，可以更有用 的殺傷腫瘤細胞，可望取得更好的治療效果。
假如運用腫瘤細胞相關的特異性發動子操控基因表達滿足量 的蓖麻毒素蛋白，可以完結特異性的殺傷腫瘤細胞，可望取得更 好的治療效果。
在常規方法中，用蓖麻毒素殺傷腫瘤細胞的難點在於病毒攜 帶的蓖麻毒素基因無法在腫瘤細胞中表達無缺毒素蛋白。其原因 是毒素A鏈損壞細胞中核糖體的功用，導致細胞無法組成蛋白而 去世。
本發明運用B鏈無毒性，可以由帶著B鏈基因的病毒在腫瘤 細胞中表達毒素B鏈。壹同通過靜脈給藥打針蓖麻毒素A鏈，則 在腫瘤組織中B鏈蛋白與A鏈結合構成有毒性的無缺毒素，在 10—"M濃度即可完結對腫瘤細胞有用殺傷，而在其他正常組織中不 表達毒素B鏈，並且因毒素B鏈能結合於細胞膜半乳糖殘基，不 易從腫瘤部位渙散到身體其他部位，正常組織中不能構成無缺毒 素，因而不體現毒性或毒性在機體可接受的極限內。
在腫瘤組織中繁殖或在腫瘤細胞中特異表達基因工程改造的 病毒，再與本發明的蓖麻毒素相結合，可望使靶向腫瘤基因治療獲 得新進展。本發明供給了壹種用蓖麻毒素殺傷腫瘤細胞的方法，該方法中蓖麻毒素B 鏈是通過基因重組方法在特定的腫瘤細胞中表達，而蓖麻毒素A鏈蛋白是通 過靜脈打針方法進入生物體內的，A鏈和B鏈構成蓖麻毒素並殺傷腫瘤細胞。 本發明蓖麻毒素蛋白的部分編碼序列（這部分序列通常在單獨存在時不 具有毒性），如蓖麻毒素B鏈的基因序列，刺進在特定腫瘤細胞中表達的病 毒載體，完結這部分毒素蛋白在特定腫瘤細胞中表達。然後表達出的蛋白通 過與打針入體內的該毒素蛋白的其余部分相結合構成有活性的毒素蛋白，從 而特異而有用殺傷腫瘤細胞。
本發明蓖麻毒素B鏈的表達載體可以是在腫瘤細胞中特異性表達的腺
病毒o
本發明蓖麻毒素B鏈的表達載體可以是在P53基因缺失或突變的腫瘤細 胞中繁殖的腺病毒。本發明構建了表達蓖麻毒素鏈蛋白的Elb缺失腺病 毒ADEla-RTB。在P53基因突變或缺失的腫瘤細胞中繁殖並表達蓖麻毒 素B鏈蛋白，當靜脈給予蓖麻毒素A鏈蛋白，可有用殺傷腫瘤細胞壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法。
本發明還將蓖麻毒素B鏈刺進E1、 E3缺失、在293細胞中繁殖、在腫瘤 細胞中非繁殖的腺病毒基因後，與腫瘤細胞基因組進行重組。構建了Ela缺 失、可在293細胞內繁殖並組裝成病毒ADdEla-RTB。在CEA (靶向癌胚抗 原）陽性腫瘤細胞內表達並排泄蓖麻毒素B鏈，當靜脈給予蓖麻毒素鏈蛋白 A鏈後，可有用殺傷腫瘤細胞。
在構建毒素蛋白表達載體時，本發明將蓖麻毒素B鏈編碼序列與腫瘤細 胞特異的發動子相銜接。如靶向癌胚抗原（CEA)發動子、耙向乳腺 癌的MUC1發動子、靶向肝癌的AFP發動子、前列腺細胞特異性 抗原PSA抗原發動子以及靶向鼻咽癌和淋巴瘤的EB病毒發動子壹種運用蓖麻毒素暗殺傷特定腫瘤細胞的方法等。
在本發明的壹個實施例中，所用腫瘤細胞特異發動子是巨細胞CMV發動子。本發明所用腫瘤細胞特異發動子也可以是腫瘤細胞端粒酶發動子。. 本發明所用的蓖麻毒素A鏈蛋白是從蓖麻籽中提取並分別純化的天然產品。
本發明所用的蓖麻毒素A鏈蛋白亦可以是基因工程產品。 除蓖麻毒素外，可用於這壹方法的還有相思豆毒素等。
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